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淋巴瘤是我国常见的恶性肿瘤，每年发病人数约为10.15万，发病率为5.56/10万，死亡人数为4.70万，死亡率为2.47/10万，而且地域之间、城乡之间的差异明显。中国临床肿瘤学会通过结合国内外指南及研究结果，制定了《淋巴瘤诊疗指南》（2023），为临床诊治提供依据。 一、淋巴瘤的分类与诊断原则目前，淋巴瘤的类型区分和诊断标准主要是依据WHO制定的造血和淋巴组织肿瘤分类（见附录）。WHO分类认为不同类型或亚型的淋巴瘤在其形态、免疫表型、遗传学以及临床表现等方面各自具备独特的特征。对这些疾病的识别，也相应建立于对上述参数全面评估、综合判断的基础之上。淋巴瘤病理诊断整合了组织形态、免疫组织化学染色、流式细胞分析、细胞遗传学以及分子生物学等多种辅助检测技术。迄今为止，组织病理学检查仍然是绝大部分淋巴瘤病例的确诊方法，而免疫组织化学染色则是判断肿瘤免疫表型以及检测部分遗传学异常的重要手段。所以，几乎所有淋巴瘤病例均需接受包括免疫组化在内的组织病理学检查之后方能确诊，部分病例的诊断和鉴别，还需辅以其他必要的检测技术。
独特的临床特点也是某些类型淋巴瘤确诊的重要依据，申请病理检查的临床医师有义务通过填写病理检查申请单提供必要的信息（包括患者的年龄、性别、活检部位等一般信息及临床表现、影像学、内镜和其他实验室检查的主要阳性发现、既往诊断、治疗史等）。病理医师也可通过查阅电子病历、直接与临床医师沟通或参加多学科讨论等多种形式获得相关信息。
二、活检与制片
1.标本获得
淋巴瘤首次病理诊断必须依据切除或切取活检（包括钳取、空芯针穿刺等）所获得的组织标本做出。足量、合格的诊断性组织是对淋巴瘤进行形态观察及开展免疫表型和遗传学研究的物质基础。对于不适合做组织学评估（例如：严重的器械性损伤或大量坏死而导致诊断性组织过少）的标本，应建议重复活检。淋巴结或某些结外病灶的完整切除标本，有助于病理医师对整个病变进行全面评估，且有足量的组织用于辅助检查，是诊断淋巴瘤最为理想的标本。如有多个解剖区域的淋巴结病灶，一般宜选择颈部病灶。手术时应注意选择最有代表性的淋巴结予以完整切除。手术动作宜轻柔，尽可能避免组织因牵拉、钳夹等造成机械性损伤。对于难以完整切除的病灶，可通过开放手术、内镜下活检或空芯针穿刺等方法获得小块组织样本供病理学检查，多数也能满足诊断需要。空芯针穿刺也是胸、腹腔等深部病灶活检最常用的方法。一般而言，细针吸取细胞学检查不能作为淋巴瘤的首诊依据，但可用于淋巴瘤疑似病例的初筛以及部分确诊病例可疑或复发病灶的确认，在某些特定情形下（例如：非实体性淋巴肿瘤、体液标本或获得病变组织较为困难时），细胞学检查亦可用于疾病诊断，但通常需辅以细胞块制作、免疫组化、流式细胞或细胞遗传学分析等辅助检查。
2.组织处理
原则上，所有淋巴结或体积较大的淋巴瘤组织标本均应在新鲜、湿润状态下尽快（离体30分钟以内）送到病理科进行处理，不能及时送检的标本可用生理盐水湿纱布包裹后放置4℃冰箱短暂保存。病理科在接收标本后应予尽快处理。较大的淋巴结标本应垂直其长轴做平行切分（每片组织厚度0.3~0.5cm），小于1cm的淋巴结可沿淋巴结长轴最大面对剖。可先行快速病理检查（冷冻切片或印片）以初步判断是否淋巴造血组织肿瘤，对于疑似淋巴瘤的病例，应选择1~2片最大的组织标本浸于4%中性甲醛溶液固定，固定时间通常为12~24小时。及时和适当时间的固定是制作高质量淋巴瘤组织切片的重要前提，不但有利于形态观察，还能较好地保存各种蛋白抗原和核酸物质，从而有利于后期免疫组化和分子生物学检测工作的开展。剩余的组织可分别用于生物样本库存档、流式细胞分析、细胞遗传学检查、病原微生物检测等。对于非淋巴瘤或疑似感染性病变的标本，应尽快将所有组织固定。对于体积较小的切取、钳取或穿刺活检标本，则应先行固定，然后再送病理科检查。对于骨髓活检标本，还应在固定后进行脱钙处理。标本组织在固定后还需进行脱水、透明、浸蜡、包埋等程序化加工才能制作切片，上述组织处理步骤目前多在自动组织处理仪中完成。
3.切片制作
高质量的常规苏木精-伊红（HE）染色切片是淋巴瘤病理诊断的重要依据。实践中，许多“疑难”病例之所以诊断困难，实际是因为制片质量不佳所导致。HE染色切片质量优劣与否，取决于组织处理、切片、染色、封固等诸多技术环节的质量控制。其中，及时而充分地固定、浸蜡前彻底脱水以及封片前透明这些步骤尤为关键。需强调的是，二甲苯透明的步骤切不可用风干操作（包括电吹风）代替，因为后者会导致细胞收缩而影响形态观察。切片厚度以2~4µm为宜。一般而言，小细胞性病变切片宜薄，大细胞性病变切片不妨略厚些；观察细胞形态切片宜薄，而观察组织结构切片不妨略厚些。概括而言，一张高质量的切片应该达到组织固定良好、组织平整、无刀痕或气泡、染色鲜艳、组织及细胞结构清晰、封固良好等技术要求。
术中冷冻切片检查对于初步区分淋巴瘤与非淋巴造血组织肿瘤有一定价值，但通常不足以确诊淋巴瘤。通过冷冻切片检查还能及早发现标本组织有严重变性、坏死、钙化等可能会影响诊断的因素，从而确保活检标本适用并足以作出明确诊断。淋巴瘤印片检查是组织切片检查的有益补充，以其方法简便、操作快捷而常被用于淋巴瘤的快速筛查。
三、组织病理学检查
1.组织学形态分析
基于常规HE染色切片的组织形态分析尤为重要。一方面，特征性的形态改变本身就对某些类型淋巴瘤的诊断有着决定性的提示作用；另一方面，相当多的辅助检查（例如：免疫表型分析、分子遗传学检测等）都必须在形态分析的基础上合理选择和使用。不但如此，这些辅助检查的结果，也只有结合形态正确解读才具有诊断价值。概括而言，淋巴瘤组织形态分析的基本原则和其他实体肿瘤相似，不外乎从肿瘤细胞的生长方式、肿瘤细胞的形态及间质反应这几个方面对肿瘤的特点予以观察、比较和总结。恶性肿瘤的一些共同特性，例如瘤细胞的异型性和破坏性生长等，在各种淋巴瘤中也有相应的表现，且通常是淋巴瘤和反应性病变鉴别的重要依据。需要指出的是，淋巴瘤的形态分析通常离不开免疫组化染色的帮助。
2.免疫组化检查
（1）免疫组化的作用
免疫组化检查对于淋巴瘤诊断与鉴别诊断的作用主要体现在以下几个方面：
①判断肿瘤的细胞系（例如：B细胞或T、NK细胞淋巴瘤）；
②判断肿瘤性免疫细胞的分化阶段和成熟程度（例如：淋巴母细胞淋巴瘤与外周B/T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤与边缘区淋巴瘤等）；
③检测某些遗传学改变（例如：CCND1、ALK等基因易位所导致的蛋白异常表达）；
④鉴别良、恶性疾病（例如：通过检测免疫球蛋白轻链有否限制性表达来判断B细胞/浆细胞是否克隆性增生）；
⑤检测病原微生物（例如：EBV、HHV8、幽门螺杆菌等）；
⑥为临床免疫或靶向治疗提供依据（例如：CD20、CD30、CD19、CD79b、CD38、PD-L1、ALK、BCL2等靶点的检测）；
⑦提示疾病预后（例如：通过检测CD10、BCL6、MUM1等指标来区分弥漫性大B细胞淋巴瘤的COO分型；通过检测MYC与BCL2蛋白表达水平来甄别“双表达”淋巴瘤）。
（2）常用标志物
可应用于淋巴瘤石蜡包埋组织免疫染色的常用标志物包括以下几个大类：
①白细胞共同抗原（CD45/LCA）；
②B细胞相关标记物，例如CD20、CD79a、CD79b、CD19、PAX5、Oct-2、BOB.1、κ、λ、IgG、IgG4、IgM、IgA、IgD、CD38、CD138、CD23等；
③T细胞/NK细胞相关标记物，例如CD3、CD2、CD5、CD7、CD4、CD8、CD43、CD45RO、CD56、CD57、细胞毒性分子（包括TIA-1、颗粒酶B、穿孔素）、T细胞受体蛋白（例如βF1、TCRG）等；
④淋巴细胞活化/分化相关标记物，例如CD30、TdT、CD99、CD10、BCL6、MUM1等；
⑤肿瘤基因和增殖相关标记物，例如ALK、BCL2、BCL10、cyclinD1、MYC、TP53、Ki-67等；
⑥组织细胞、树突细胞及髓系相关标记物，例如CD68（KP1、PGM1）、CD163、溶菌酶、髓过氧化物酶（MPO）、CD15、CD33、CD34、CD61、CD235a、CD123、CD117、CD21、CD35、S-100、CD1a、CD207/langerin等；
⑦微生物标志物，例如EB病毒（EBV）-LMP1、HHV8等；
⑧其他，例如EMA、细胞角蛋白、LEF1、MNDA、PD1、PD-L1、CXCL13等。
（3）免疫组化诊断注意事项
①免疫组化检查首先应确保染色质量，一定要从组织处理、制片、抗原修复、抗体选择、染色程序等诸多环节加强监控，并通过设置合理的阳性对照作平行染色，以确保染色质量稳定保持在较高水平。
②要熟悉各类淋巴瘤组织学形态和免疫表型，在形态分析基础上，有所针对地选择必要的抗体组合来证实诊断或帮助鉴别，不应使用抗体“大套餐”做过度检测。
③应学会正确判读免疫组化染色结果。这就要求病理医师做到：
a.熟悉各种抗体的预期染色结果，并通过适当内、外对照来判断染色成功与否；
b.在形态分析基础上正确判断何种细胞成分表达何种抗原；
c.熟悉各种抗体的反应谱系和适用范围，避免片面或错误解读阳性结果。
（4）常用标志物组合的选择①对于需做免疫组化检查的淋巴组织增生性病变而言，几乎所有病例需要检测CD20、CD3和Ki-67。这一组合能够凸显淋巴组织的免疫结构，有助于良、恶性病变的鉴别，并能提示淋巴瘤的细胞系起源。②对于呈滤泡/结节状生长模式的病变，可选择CD10、BCL6、CD21、Ki-67等指标来显示结节和淋巴滤泡的关系，初级滤泡样结构不表达CD10、BCL6，但IgD阳性。③对于疑似小B细胞肿瘤性病变（包括低级别滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤等），可选用CD10、BCL6、BCL2、CD5、CD23、cyclinD1、SOX11、LEF1和MNDA这一组指标予以鉴别诊断。④对于富含浆细胞的病变，可检测免疫球蛋白轻链（κ/λ）有无限制性表达以区分良、恶性。⑤对于疑似高侵袭性成熟B细胞肿瘤的病变（包括绝大部分弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及具有前两者中间特征的B细胞淋巴瘤（BCLU）或高级别B细胞淋巴瘤（HGBL）、高级别滤泡性淋巴瘤等），选用CD10、BCL6、BCL2、MUM1、MYC这一组指标（并结合细胞遗传学检查）有助确诊并区分亚型；CD30、EBV-LMP1、CD5和TP53的检测对于弥漫性大B细胞淋巴瘤有预后意义或治疗价值。⑥对于疑似T细胞或NK细胞肿瘤的病变，可选择性检测CD2、CD5、CD7、CD4、CD8、CD10、CD30、CD56、ALK、CXCL13、PD1、T细胞受体蛋白、细胞毒性分子等标志物并行EBER原位杂交来帮助判断肿瘤类型。⑦对于经典型霍奇金淋巴瘤或类似病变（例如：具有经典型霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中间特征的灰区淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤等），可选用CD20、PAX5、Oct-2、BOB.1、CD30、CD15、EBV-LMP1（或EBER）、EMA、PD1等指标组合，此外，还应注意部分外周T细胞淋巴瘤也可伴有霍奇金样异型大B细胞浸润，增生的T细胞有无异型性、是否克隆性增生是鉴别诊断的关键。⑧富于细胞的经典型霍奇金淋巴瘤与ALK阴性的间变性大细胞淋巴瘤有时不易区分，检测B、T细胞系标志物，细胞毒分子并结合IG、TCR基因重排检测会有帮助。⑨对于混合B、T细胞增生性病变，应结合形态分析正确区分肿瘤细胞和反应性成分。少数情况下，也不排除组合表型的淋巴瘤可能，但诊断后者应有充分的病理学和分子遗传学证据。⑩对于形态高度疑似淋巴造血组织肿瘤、但CD20和CD3均不表达的病变，通常需要检测部分“二线”细胞系标志物（如CD79a、PAX5、CD19、Oct-2、BOB.1、浆细胞相关抗原、CD3以外的全T细胞抗原及CD43、CD68、MPO等髓细胞标志物等）来帮助判别细胞系。 四、流式细胞术分析基于流式细胞技术的免疫表型分析也是淋巴瘤诊断和分型的重要手段，有技术条件的病理实验室应积极开展。相比免疫组化，流式细胞术具有敏感度高、特异性强、检测周期短等特点，特别是对于判断B、T细胞的克隆性增生，抗原表达水平以及小B细胞类肿瘤鉴别诊断等方面具有独特的优势，其弱点在于不能结合组织学形态分析（免疫组化可以在原位标记抗原）、不适合检测部分定位于细胞核或细胞质内的抗原（如BCL6、MUM1、cyclinD1、Ki-67、BCL2等）、对于霍奇金淋巴瘤等肿瘤细胞较少的病变以及T细胞或NK细胞肿瘤的甄别能力不如免疫组化强。此外，流式细胞分析需要细胞悬液或由新鲜组织制备的单细胞悬液标本，不常规留用新鲜组织标本的单位无法开展这项技术，细胞悬液标本也不像组织块可以长期保存，故而流式细胞不能用于回顾性研究。 五、遗传学与分子病理检测淋巴瘤中抗原受体基因（IG、TCR）的克隆性基因重排、非随机、类型相关性染色体及基因异常、特定病原微生物感染等不仅对于研究肿瘤的发生、发展机制具有重要意义，也是精确诊断疾病、指导规范治疗以及预测预后必不可少的工具。常用的淋巴瘤遗传与分子病理检测方法包括聚合酶链反应（PCR，包括RT-PCR、RQ-PCR等）和Sanger测序技术、荧光原位杂交（FISH）、原位杂交（ISH）、核型分析（包括G显带、M-FISH、SKY等）及基因表达谱（GEP）、二代测序（NGS）等高通量检测技术。1.克隆性IG和TCR基因重排检测（1）方法多数实验室采用PCR法并应用BIOMED-2引物组检测，以毛细管电泳基因扫描分析结果（或PAGE电泳异源双链分析）。（2）适用范围绝大部分淋巴组织增生性病变根据形态特征并结合免疫组化检查和临床特点便能确诊，无须开展这项检测。仅在少数情形下，克隆性IG和TCR基因重排检测对于淋巴瘤的诊断与鉴别、肿瘤细胞系确定以及克隆相关性分析具有一定价值：①良、恶性较难鉴别的病变，例如，淋巴瘤局限或隐匿性累犯、形态异常不显著或缺乏特征性免疫表型的淋巴瘤（如在某些炎性疾病基础上发生瘤变的早期MALT型边缘区淋巴瘤、EBV相关淋巴瘤等）、小细胞性皮肤淋巴瘤早期病变等；②疑似淋巴瘤，但标本组织较小、较少，例如，不理想的穿刺活检或内镜活检标本、体液标本等；③某些特定病种的诊断与鉴别，例如，儿童型滤泡性淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、水疱-痘疮样淋巴瘤等；④细胞构成较复杂或免疫标记难以区分细胞系的肿瘤，例如，肿瘤细胞异常表达CD20的外周T细胞淋巴瘤、伴有B细胞成分旺炽增生的外周T细胞淋巴瘤或B、T细胞组合性淋巴瘤等；⑤肿瘤克隆相关性分析，例如，判断弥漫性大B细胞淋巴瘤是否由之前滤泡性淋巴瘤转化而来；⑥微小残留病灶评估。（3）判读结果注意事项IG和TCR基因克隆性重排检测结果，一定要在组织病理学检查的背景下解读才有意义，如与形态或免疫组化证据不符，一般更倾向于组织学检查结论。判读基因重排结果，应注意以下事项：①克隆性不一定等于淋巴瘤，部分良性病变也可有淋巴细胞克隆性增生。②部分B或T细胞淋巴瘤（特别是淋巴母细胞性肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤等）IG和TCR基因重排检测结果存在谱系交叉，不足以判断肿瘤细胞系起源。此外，TCRB和TCRG基因重排也并不代表就是αβ 和γδT细胞来源的肿瘤。③假克隆和寡克隆，由于PCR技术的高敏性，标本组织中较少的细胞成分有时会产生假克隆或寡克隆，需与真性克隆性病变鉴别。④某些技术因素也会导致假阳性或假阴性结果。2.FISH法检测非随机性染色体和基因异常部分B细胞非霍奇金淋巴瘤亚型和少数T细胞淋巴瘤具有特征性的、非随机性染色体异常（例如：染色体易位、缺失等），并导致相关基因异常，检测这些遗传学异常有助于病理诊断或评估预后。目前，FISH是临床检测这些染色体/基因异常最常用的方法，也有多种针对染色体易位断裂区和基因缺失（或扩增）的商品化探针供应，针对易位的探针又包括融合探针和分离探针两种，分别是针对不同基因或同一基因断裂位点两侧序列而设计，前者例如t（14；18）（IgH/BCL2）、t（11；14）（IgH/CCND1）等，后者例如t（18q21）（BCL2）、t（3q27）（BCL6）、t（8q24）（MYC）、t（14q32）（IgH）、t（18q21.31）/MALT1等。需要指出的是，部分染色体易位/基因重排可以通过更为简易、经济的免疫组化方法予以间接提示，例如，套细胞淋巴瘤相关的t（11；14）和间变性大细胞淋巴瘤相关的t（2p23）就分别可以通过cyclinD1和ALK的免疫组化染色来加以显示，在这些情形下，FISH检测就并非必需。但对于那些蛋白表达并不一定对应于基因异常的情形（例如：弥漫性大B细胞淋巴瘤中BCL2和/或BCL6与MYC基因重排检测、有BCL2基因易位但免疫组化结果阴性的滤泡性淋巴瘤等）而言，FISH检测就是必要的方法。此外，部分遗传学异常对应于肿瘤的生物学异质性，例如，伴有t（2p23）（ALK）、t（6p25）（DUSP22-IRF4）和t（3q28）（TP63）的间变性大细胞淋巴瘤以及伴有del（17p）、del（11q）、del（13q）、+12等异常的慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤就有着不同的生物学行为，通过FISH检测这些遗传学异常，能提示疾病预后，并指导治疗。3.EBER原位杂交检测EBV感染与多种良、恶性淋巴组织增生性疾病（后者包括多种B细胞和T细胞/NK细胞淋巴瘤以及部分经典型霍奇金淋巴瘤等）相关。EBER-1/2是EBV编码的两个小分子量早期核糖核酸，常高水平地表达于病毒感染的细胞核中。利用EBER探针作原位杂交可以敏感地在原位显示病毒感染，如结合细胞系标志物免疫染色作双重标记，则还能显示病毒阳性细胞的表型。通过免疫组化检测EBV编码的部分蛋白抗原（如LMP1、LMP2A、EBNA等）虽也能显示病毒存在，但这些抗原的表达情况在病毒不同感染模式中有所不同（如EBV阳性的经典型霍奇金淋巴瘤通常表达LMP1，而EBV阳性的伯基特淋巴瘤则通常LMP1阴性），而EBER却是恒定表达的，且免疫组化检测灵敏度也往往不如原位杂交，因此，EBER原位杂交技术通常被视作组织内原位检测EBV的“金标准”。4.二代测序、基因表达谱等高通量技术检测随着分子生物学研究的深入，一些重现性基因突变（或其他异常）被发现在特定类型的淋巴瘤中高频发生，提示这些异常可能参与了肿瘤的发生、发展机制。其中，有不少特定的基因突变已被应用于淋巴瘤的诊断、分型、预测预后，乃至辅助临床作治疗决策。近年来，Sanger测序、二代测序等技术被越来越多地使用到淋巴瘤的分子病理诊断当中，特别是高通量的二代测序技术具有单次实验能够检测多个基因变化以及多种遗传学异常（基因突变、易位、缺失等）的优势，大有替代其他测序技术的趋势。就淋巴瘤相关基因二代测序在临床应用而言，建议优先选择一组与诊断、预后判断和治疗选择密切相关的基因进行检测。基因表达谱是指一次同时定量检测特定组织中成千上万个基因的表达，再根据基因表达种类和丰度信息，构建出基因表达的数据表或谱型（或称指纹）。在淋巴瘤领域，弥漫性大B细胞淋巴瘤是第一种通过基因表达谱信息进行分子分型的肿瘤。此外，Nanostring公司推出的nCounter技术也能高度灵敏地定量检测多种样品类型（纯化总RNA、细胞和组织裂解液、石蜡包埋组织提取的RNA等）中的基因表达，该技术应用分子条形码和单分子成像来检测并计数单个反应中的几百个转录本，而不需要逆转录或扩增反应，直接数字化读出每一种mRNA的相对丰度。利用Nanostring平台的20基因检测（Lymph2Cx）研究已表明该项技术可以对弥漫性大B细胞淋巴瘤石蜡包埋标本进行准确的分子分型。 附录2022年第5版WHO淋巴组织增生及肿瘤分类图片
参考文献及书籍：中国临床肿瘤学会指南工作委员会. 中国临床肿瘤学会(CSCO)淋巴瘤诊疗指南 2023[M]. 北京 :人民卫生出版社, 2023. 本站仅提供存储服务，所有内容均由用户发布，如发现有害或侵权内容，请点击举报。